彗星試驗(yàn)原理及注意事項(xiàng)

體內(nèi)堿性彗星試驗(yàn)在化合物遺傳毒性評價(jià)中的應(yīng)用日益廣泛。ICH S2(R1)已將肝臟彗星試驗(yàn)列為第2個組織/終點(diǎn)的體內(nèi)試驗(yàn)；體內(nèi)哺乳動物堿性彗星試驗(yàn)的指導(dǎo)原則（TG489）也已頒布。體內(nèi)堿性彗星實(shí)驗(yàn)?zāi)軌驒z測DNA鏈斷裂、堿性不穩(wěn)定位點(diǎn)、不完整切除修復(fù)引起的DNA鏈的斷裂，能夠制成合適細(xì)胞懸液的組織DNA損傷。與其他試驗(yàn)相比其檢測的是單細(xì)胞水平的DNA損傷，因此該試驗(yàn)敏感性較高，操作簡單，經(jīng)濟(jì)省時。

實(shí)驗(yàn)原理

彗星實(shí)驗(yàn)（comet assay）也稱單細(xì)胞凝膠電泳試驗(yàn)（single cell gel electrophoresis.SCGE）,是一種有效評估DNA損傷的方法。其原理是器官或組織經(jīng)處理（如輻射、重金屬等）后，細(xì)胞中的DNA發(fā)生單鏈或雙鏈斷裂，經(jīng)細(xì)胞及其核膜裂解后，DNA解旋，在電場作用下，DNA 斷片遷移出細(xì)胞核，形成彗星狀的電泳圖譜。正常細(xì)胞的大分子DNA在電場作用下遷移距離較短，DNA仍保留在細(xì)胞核的范圍，形成圓形或輕微拖尾的圖譜。根據(jù)電泳緩沖液的pH值不同，可分為中性彗星實(shí)驗(yàn)（pH=8.4）和堿性彗星實(shí)驗(yàn)（pH＞13）。中性彗星實(shí)驗(yàn)主要用于檢測DNA雙鏈的斷裂損傷，堿性彗星實(shí)驗(yàn)具有更高的靈敏性，可用于檢測更少量的單鏈和雙鏈斷裂損傷。

需要注意的是，試驗(yàn)過程中的個方面，包括樣品準(zhǔn)備、電泳條件、視覺分析參數(shù)(如染色強(qiáng)度、顯微鏡光強(qiáng)度以及使用顯微鏡濾鏡和相機(jī)動態(tài)和環(huán)境條件(如背景照明)已經(jīng)被研究，可能影響DNA遷移。

堿性彗星實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)原則

TG489 In Vivo Mammalian Alkaline Comet Assay，2016，OECD Guideline for the Testing of Chemicals