生物實驗室的蛋白定量“金標(biāo)準(zhǔn)”：BCA試劑盒完-全解析

Keywords：BCA蛋白濃度測定試劑盒；BCA；蛋白定量；標(biāo)準(zhǔn)曲線；BCA Protein Concentration Assay Kit；Bicinchoninic Acid；Protein Assay；Standard Curve;

在蛋白質(zhì)功能研究的眾多方法中，BCA法以其高靈敏度、對去垢劑出色的耐受性及操作簡便等特點，成為實驗室廣泛采用的經(jīng)典選擇，尤其適用于成分復(fù)雜的細(xì)胞或組織裂解液。鑒于此，IPHASE作為體外研究生物試劑引-領(lǐng)者，開發(fā)、生產(chǎn)了BCA蛋白濃度測定試劑盒（BCA Protein Concentration Assay Kit），為客戶的生物試劑蛋白定量提供“一站式"服務(wù)。下文將帶您快速掌握BCA法的核心原理與IPHASE BCA蛋白濃度測定試劑盒標(biāo)準(zhǔn)化操作。

01    BCA 蛋白濃度測定原理

BCA 法是對經(jīng)典 Lowry 法的改進(jìn)，克服了后者步驟繁瑣、對干擾物敏感等局限性，具有操作簡便快捷、靈敏度高、線性范圍寬、抗干擾性能優(yōu)良、兼容性能好及經(jīng)濟(jì)實用等多種優(yōu)勢。

BCA（Bicinchoninic Acid，2,2-聯(lián)喹啉-4,4-二甲酸二鈉）蛋白質(zhì)定量法是一種廣泛應(yīng)用的蛋白質(zhì)檢測方法，其原理基于蛋白質(zhì)的還原。蛋白質(zhì)在堿性條件下可將二價銅離子（Cu2?）還原為一價銅離子（Cu?），隨后一價銅離子進(jìn)一步與BCA試劑形成穩(wěn)定的紫色絡(luò)合物，且該絡(luò)合物在562 nm波長處具有最-大吸光度，通過測量吸光度即可定量蛋白質(zhì)濃度。具體而言，反應(yīng)分為兩步：第-一步，在堿性條件下，蛋白質(zhì)中的肽鍵、酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸殘基能夠還原Cu2?為Cu?。第二步，生成的Cu?與兩個BCA分子螯合，形成紫色的Cu?-BCA絡(luò)合物。該方法靈敏度高、操作簡便，且對某些去污劑具有較好的耐受性。

（圖片來源于網(wǎng)絡(luò)）

02    IPHASE BCA蛋白濃度測定試劑盒操作步驟

根據(jù)以上原理，IPHASE BCA蛋白濃度測定試劑盒（BCA Protein Concentration Assay Kit）采用改良型 BCA 法配方，并根據(jù)儀器不同，分別提供按照“酶標(biāo)儀"及“分光光度計"的操作流程，客戶可根據(jù)現(xiàn)有儀器按需購買、操作。具體操作步驟及數(shù)據(jù)分析如下：

（1）稀釋標(biāo)準(zhǔn)品

使用PBS稀釋液將2 mg/mL BSA標(biāo)準(zhǔn)品依次稀釋即得到如下濃度系列的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品：

（2）配制BCA工作液

將BCA試劑與Cu試劑按50:1的體積比充分混合，即得BCA工作液。

（3）準(zhǔn)備待測樣本

將您的未知蛋白樣本進(jìn)行適當(dāng)稀釋（建議在預(yù)實驗中摸索最-佳稀釋倍數(shù)，使測量值落在標(biāo)準(zhǔn)曲線中部）。

（4）加樣

①酶標(biāo)儀法：準(zhǔn)確移取標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品和試驗樣品各20 μL至96孔酶標(biāo)板中。推薦每個樣品設(shè)置2~3個復(fù)孔。每孔加入200 μL BCA工作液，加蓋封板膜，輕輕振蕩混勻。

②分光光度計法：準(zhǔn)確移取標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品和試驗樣品各100 μL加至標(biāo)記好的5 mL離心管中。每管加入2 mL BCA工作液，混勻。

（5）孵育與檢測

①酶標(biāo)儀法：37℃恒溫孵育30min，冷卻至室溫后，在3~5min內(nèi)使用酶標(biāo)儀讀取562 nm波長下的吸光度值。

②分光光度計法: 37℃恒溫孵育30min，冷卻至室溫后，在3~5min內(nèi)轉(zhuǎn)移至比色皿中，使用分光光度計讀取562 nm波長下的吸光度值。

注：IPHASE BCA蛋白濃度測定試劑盒使用分光光度計法可進(jìn)行50 test；使用微孔法可進(jìn)行500 test.

03    數(shù)據(jù)處理與結(jié)果分析

（1）推薦使用四參數(shù)模型進(jìn)行曲線擬合。

（2）將樣品的吸光值代入回歸方程，計算蛋白濃度。

（3）若樣品經(jīng)過稀釋，最終蛋白濃度需乘以稀釋倍數(shù)。

（4）若蛋白濃度超過檢測范圍（0.02~2 mg/mL），請稀釋樣品后重新測定。

總而言之，IPHASE BCA蛋白濃度測定試劑盒，其顯色穩(wěn)定性更強(qiáng)、線性范圍更寬、重復(fù)性更好，可廣泛應(yīng)用于哺乳動物、細(xì)菌、組織、細(xì)胞裂解液、純化蛋白等多種樣品的蛋白濃度定量測定，是蛋白研究道路上不-可-或缺的工具。