小鼠肝微粒體活性測定與保存方法

　　小鼠肝微粒體是體外藥物代謝、酶活性研究的核心生物材料，其活性穩定性直接決定實驗結果的可靠性。以下是肝微粒體活性測定的關鍵方法和標準化保存流程，步驟清晰、可操作性強。
 

　　一、 小鼠肝微粒體活性測定(以 CYP450 酶活性為例)
 

　　CYP450 酶是肝微粒體中負責藥物代謝的核心酶系，常用對硝基苯甲醚(PNOD)脫甲基反應測定 CYP1A2 活性，作為肝微粒體活性評價的指標。
 

　　1. 試劑與耗材準備
 

　　緩沖液：0.1mol/L 磷酸鉀緩沖液(pH 7.4)、10mmol/L PNOD 底物溶液(甲醇溶解)、10mmol/L NADPH 再生系統(含 NADPH、葡萄糖 - 6 - 磷酸、葡萄糖 - 6 - 磷酸脫氫酶)
 

　　器材：低溫離心機、酶標儀、恒溫水浴鍋、EP 管、移液槍
 

　　2. 活性測定操作步驟
 

　　反應體系配制(總體積 200μL，冰上操作)


 

　　空白對照組：用緩沖液替代肝微粒體蛋白液。
 

　　孵育反應
 

　　37℃恒溫水浴孵育 30min，精準控制時間。
 

　　加入 50μL 1mol/L 鹽酸終止反應。
 

　　產物檢測
 

　　加入 150μL 1mol/L *溶液，振蕩混勻，室溫靜置 10min。
 

　　酶標儀 405nm 波長下測定吸光度值(OD 值)，根據對硝基苯酚標準曲線計算產物生成量。
 

　　活性計算
 

　　酶活性單位定義：每分鐘生成 1nmol 對硝基苯酚所需的酶量為 1 個活性單位(U)。
 

　　公式：酶活性(U/mg 蛋白)= 產物生成量(nmol)÷ 孵育時間(min)÷ 蛋白濃度(mg/mL)
 

　　3. 其他活性指標測定
 

　　葡萄糖醛酸轉移酶(UGT)活性：以 4 - 甲基傘形酮為底物，測定熒光產物生成量。
 

　　谷胱甘肽 S - 轉移酶(GST)活性：以 1 - 氯 - 2,4 - 二硝基苯為底物，檢測 340nm 處吸光度變化。
 

　　二、 小鼠肝微粒體的保存方法
 

　　肝微粒體易失活，需嚴格控制保存條件，核心原則是低溫、避光、防反復凍融。
 

　　1. 短期保存(≤7 天)
 

　　新鮮制備的肝微粒體蛋白液，用磷酸鉀緩沖液調整蛋白濃度至 10-20mg/mL。
 

　　分裝為 50-100μL / 管(避免反復凍融)，置于 **-20℃冰箱 ** 保存。
 

　　適用場景：短期內需完成的實驗，保存期間活性會緩慢下降，建議 7 天內用完。
 

　　2. 長期保存(數月至數年)
 

　　添加保護劑：在肝微粒體蛋白液中加入終濃度 10%-20% 的甘油(分析純)，充分混勻，甘油可降低冰點，保護酶結構。
 

　　分裝凍存：按單次實驗用量分裝至無菌 EP 管，管內避免留氣泡，密封管口。
 

　　梯度降溫凍存
 

　　先置于 4℃冰箱 30min，再轉移至 - 80℃超低溫冰箱，避免溫度驟降導致蛋白變性。
 

　　有條件的可使用程序降溫盒，降溫速率控制在 - 1℃/min，凍存效果更佳。
 

　　液氮保存：若需保存數年，可將分裝后的肝微粒體轉移至液氮罐(-196℃)，酶活性幾乎無損失，適合珍貴樣品。
 

　　3. 凍存后復蘇與使用要點
 

　　復蘇：從低溫冰箱取出后，立即置于 37℃水浴鍋中快速解凍，輕輕顛倒混勻，避免劇烈振蕩。
 

　　解凍后處理：解凍后的肝微粒體需在冰上放置，1h 內完成實驗；嚴禁反復凍融，否則酶活性會急劇下降(凍融 1 次活性損失可達 30% 以上)。
 

　　活性驗證：長期保存的肝微粒體，使用前需重新測定酶活性，確保活性滿足實驗要求。
 

　　三、 注意事項
 

　　活性測定全程需冰上操作，防止肝微粒體在室溫下失活。
 

　　蛋白濃度測定建議用 BCA 法，避免考馬斯亮藍法對酶活性的干擾。
 

　　保存時需在管身標注制備日期、蛋白濃度、活性值，便于后續取用。
 

　　長期保存的肝微粒體，應避免頻繁開關冰箱門，減少溫度波動。