ADC藥物非臨床體外研究“一站式”解決方案

抗體偶聯藥物（Antibody-Drug Conjugate，ADC）是通過連接子將小分子化合物偶聯至靶向性抗體或抗體片段上的一類新型的生物技術藥物，可以增強藥物的靶向性和穩定性，同時減少臨床毒副反應、提高治療指數，且兼具傳統小分子藥物的殺傷效應和抗體藥物的靶向性，當下主要是應用于抗腫瘤或者其他疾病的靶向治療的熱門藥物，是新型的“生物導-彈"。

因此，ADC藥物一般由單克隆抗體（mAb）、載荷小分子（payload）和連接子（Linker）三部分組成，通過抗體靶向腫瘤細胞表面抗原，將細胞毒素精準高效地遞送到腫瘤部位，同時避開正常組織，發揮高其特異性靶向能力和強效的殺傷作用。這復雜的“精準導-彈"目標，對ADC藥物提出了高穩定性、高利用率的要求，即ADC藥物既要在血液循環中維持穩定，又要在到達腫瘤部位精準釋放，所以體外研究ADC藥物血液穩定性、小分子毒素payload釋放及代謝具有重要意義。本篇文章將整體闡述ADC藥物體外研究思路并提供“一站式"解決方案。

根據中國國家藥監局藥審中心（NMPA）發布的關于《抗體偶聯藥物非臨床研究技術指導原則》指示，對ADC藥物的研究應從藥理學、安全藥理學、藥代動力學及毒理學等四個方面展開。

一、ADC藥物在體外血液基質中穩定性研究的策略

藥代動力學藥物體外研究的重中之重。作為抗腫瘤藥物，ADC藥物應在血液循環中保持穩定，避免載荷釋放過早導致毒素積累和發生不良反應。NMPA發布的指導原則其明確指出：“臨床試驗開展前，需在人和動物（藥理試驗和/或毒理試驗動物）的血漿和/或全血等介質中考察ADC的體外穩定性。"因此，采用血液基質在體外評估ADC藥物的穩定性是合理且方便的方法。

血漿（Plasma）是血液的重要組成部分，為淡黃色液體，由蛋白質、脂類、無機鹽、糖、氨基酸、代謝廢物以及大量的水組成，由血液和抗凝劑混合后進一步離心所得，其內不含或含極少血細胞，是ADC體外穩定性評價的最常規基質。常規小分子藥物的抗凝劑有EDTA、肝素鈉或肝素鋰，而ADC藥物由于其本身結構的復雜性，常規EDTA抗凝劑為蛋白酶和核酸酶的抑制劑，所以EDTA抗凝劑類血漿不適用于體外ADC藥物穩定性考察。

血清（Serum）則是利用促凝管將血液完-全凝固離心后的黃色透明液體，其內不含纖維蛋白原，也避免了可能由抗凝劑引起的蛋白結合、酶活抑制和樣品穩定性等方面的風險，已逐漸成為ADC藥物體外穩定性評價的另一介質。無論是血漿還是血清，為模擬體內穩定性，均應將ADC藥物添加在血漿/血清中，于37℃下進行孵育，孵育時常最長不超過21天。由于孵育時間較長，所以應避免在這期間內血液基質出現污染的情況。因此，有部分客戶也會選擇使用無菌血漿/血清進行驗證。最后可檢測ADC的變化和/或游離payload的生成。目前捕獲ADC藥物的一種方法是將ADC中抗體對應的二抗加入到孵育后的溶液中，再結合SA磁珠，即可將ADC藥物從孵育液中吸附出來，而后使用LC-MS/MS或其它儀器進行藥物分析。

全血(Blood)基質最-接近體內真實環境，包含血細胞和血漿所有成分，也是NMPA推薦的體外穩定性驗證體系之一。但全血因含血細胞成分，僅能使用新鮮基質進行試驗，不適合低溫凍存，也不方便運輸，且全血在孵育24小時以上伴隨著血細胞不斷破裂的風險，所以對于需長時間孵育的ADC藥物來說，適用性有限。也因此，目前對于ADC藥物使用全血進行體外穩定性驗證的數據較少。

二、ADC藥物的藥理/毒理學研究

【ADC藥物的藥理/藥效學研究】

體外藥理/藥效學研究對ADC的抗體部分要求更高。ADC藥物的重要組成是抗體，由Fab端和Fc端組成，Fab端主要發揮抗原結合功能，而Fc端決定抗體的效應功能，包含抗體依賴的細胞介導的細胞毒性作用（Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC）、抗體依賴性細胞介導的吞噬作用（Antibody-Dependent Cellular Phagocytosis，ADCP）及補體依賴的細胞毒性作用（Complement Dependent Cytotoxicity，CDC）效應。

ADCC，是指抗體通過Fab段與靶細胞（病毒感染的細胞及腫瘤細胞）表面抗原決定簇特異性結合后，其Fc段可與有FcγR的殺傷細胞【NK細胞（Natural Killer Cell，NK）、單核細胞（Monocytes）、巨噬細胞（Macrophages，m?）、中性粒細胞（Neutrophil）】等效應細胞結合，觸發效應細胞的殺傷活性，直接殺傷靶細胞（病毒感染的細胞及腫瘤細胞），這個過程稱為ADCC。

與ADCC不同，ADCP也是用于識別和介導治療性抗體作用于腫瘤細胞的一種重要機制。于ADCP而言，FcγRIIa是該過程的主要FcγR受體，該過程由單核細胞、巨噬細胞、嗜中性粒細胞和樹突細胞（Dendritic cells, DC）通過表達FcγRIIa（CD32a）、FcγRI（CD64）和FcγRIIIa（CD16a）來介導來吞噬疾病細胞。

除了上述兩種抗體依賴性效應，也需考慮補體系統帶來的細胞毒性作用，即CDC效應。補體系統是重要的免疫調節系統，由多種血清蛋白組成的級聯酶促反應，其家族成員超過40種蛋白質。其中補體依賴的細胞毒性，指的是補體參與的細胞毒作用，即通過特異性抗體與細胞膜表面相應抗原結合，形成復合物而激活補體經典途徑，所形成的攻膜復合物（MAC）對靶細胞發揮裂解效應。

因此，針對ADC藥物的研究還需考慮抗體本身帶來的效應功能，IPHASE作為體外研究生物試劑引-領者，采用自研產品，針對不同效應功能，采用合適的藥物進行驗證篩選，以便為不同客戶提供最佳方案！以ADCC效應為例，發揮效應功能主要依賴于PBMC中的NK細胞或NK細胞本身，而PBMC是較為常規的試驗系統選擇，因此，合適的PBMC于抗體客戶而言至關重要。鑒于此，IPHASE技術人員將PBMC、腫瘤細胞（Raji）與抗體藥物利妥昔單抗（RTX）共孵育，同時不含RTX組為對照組。經觀察發現，試驗組（含RTX）較對照組而言，抗體藥物濃度越高，殺死的腫瘤細胞越多，并最終趨于一個最大值。說明此批次PBMC ADCC效應的殺傷率可達30%以上，是客戶進行抗腫瘤或抗感染研究的不-二選擇！

而針對于ADCP和CDC效應，IPHASE也擁有如單核細胞、樹突狀細胞、巨噬細胞及提供補體的人和SPF級猴血清等產品，為客戶的藥理學研究提供多種選擇！

【ADC藥物抗體部分的毒理學研究】

于復雜的ADC藥物而言，抗體部分的毒理學研究也尤為重要。單克隆抗體( (Monoclonal antibody, mAb)類藥物通常具有特定的免疫特性，除與適應癥相關特定靶部位抗原結合外，若人體正常組織中存在相同或相似的抗原決定簇，還會與靶器官外的組織或細胞結合從而產生嚴重的不良反應。因此，組織交叉反應(Tissue Cross-Reactivity，TCR)試驗應運而生，即在體外檢測單抗或相關抗體樣生物制品與組織上的抗原決定部位結合的試驗，常用檢測方法為免疫組織化學技術（Immunocytochemistry, IHC），該試驗是抗體類藥物I期臨床前安全性評價的重要組成部分。為確保抗體類藥物的安全性，合理設計的TCR研究設計，規范的試驗操作，能夠有效控制試驗結果的準確性，從而判定抗體類藥物是否存在組織交叉反應。TCR試驗的結果可幫助確認受試抗體與藥效靶組織抗原決定部位的結合，檢測抗體是否與非靶部位組織抗原(如組織交叉反應抗原)結合，確定非臨床安全性試驗相關動物種屬，以及預測毒性靶器官。

依據美國FDA的PTC指南和NMPA人用單克隆抗體質量控制技術指導原則中的要求，組織交叉反應（Tissue Cross-Reactivity，TCR）研究所需的組織材料應為手術或者活檢的新鮮組織，用恰當的取材、固定及保存方法制備成冰凍切片或石蠟切片。并且，正常人體冰凍組織至少要選擇3套來自不同個體的捐獻者，而非人靈長類動物及嚙齒類動物冰凍組織則至少選擇2套來自不同的動物個體。鑒于此，IPHASE以市場為導向，憑借在醫藥研發領域幾十年深耕的經驗和完善的產品研發生產平臺，現可提供高品質的石蠟包埋組織、OCT包埋組織、冰凍組織及對應處理方式的組織切片等多個品類的正常人體組織、猴組織和其它動物組織的產品，并可提供相應的免疫組化染色產品，為客戶的TCR試驗提供原材料。以下為FDA要求的32種組織。

注：以上組織除血細胞外本司均可同時提供切片及芯片，血細胞僅可提供切片

三、ADC藥物的Linker切割及payload釋放

作為靶向抗體和小分子毒素payload的連接子，Linker的重要性不言而喻。根據其在細胞內的水解方式，通常可分為“可切割連接子"和“不可切割連接子"兩種形式。

【ADC藥物的可切割連接子類型】

可切割連接子被設計為對細胞外和細胞內環境差異（pH、氧化還原電位等）表現出化學不穩定性，或者可以被特定的溶酶體（lysosome）酶切割。化學切割連接子通常包括酸裂解（腙鍵/碳酸脂）和可還原裂解（二硫鍵）。前者對體內酸性環境高度敏感，利用內體（endosome,PH 5.5~6.2）和溶酶體（PH 4.5~5.0)的酸性環境觸發連接子的斷裂，隨后釋放有效載荷。該類型連接子藥物血漿穩定性差、半衰期短，且只能使用中度細胞毒性的payload。如有研究發現，具有腙鍵的連接子在生理條件下（PH=7.4，37℃）也可以發生緩慢水解，從而導致毒性載荷的緩慢釋放，典型的就是曾被召回的“吉妥單抗“藥物。作為另一類可還原連接子二硫鍵則是具有還原型谷胱甘肽依賴性，細胞質中谷胱甘肽水平（1–10 mmol/L）較血漿（～5μmol/L）中更高，因此還原型二硫鍵連接子在血液循環中相對穩定，在細胞內谷胱甘肽還原裂解二硫鍵連接子以釋放有效載荷。該種方式的連接子切割通常其大部分有效載荷不帶有自由巰基，可以與自-焚型單元接上自由巰基后，再形成二硫鍵。

另一種常見的可切割連接子是酶裂解形式連接子。即通過利用細胞中獨-特的高濃度水解酶來切割并釋放藥物，包括多肽類（Polypeptide）、葡萄糖苷酶類（Glucosidase）、磷酸酶（Phosphatase）、硫酸酯酶（Sulfatase）及天冬酰胺內肽酶（萊古酶，Legumain）等連接子，其中多肽類連接子是利用細胞內吞作用將ADC藥物內化，進而借助肝溶酶體中的組織蛋白酶來選擇性地裂解連接子。目前已知組織蛋白酶B（Cathepsin B）可特異性的切割常見的陽性藥物德曲妥珠單抗（Enhertu，DS8201）的四肽連接子GGFG和二肽VC連接子。作為酶可連接型連接子，其穩定性較酸裂解及GSH可切割型連接子更穩定，通常與自-焚型結構結合使用，是目前較為常見的連接子類型。

由上可知，可切割連接子具有多種類型，因此，選擇合適的體系進行切割對于試驗的順利推行具有重要意義！目前常見的payload釋放的體外試驗系統有酸化肝勻漿液（Liver Homogenate，PH 5.0-6.0）、酸化肝S9（Liver S9 Fraction，PH 5.0-6.0）、肝溶酶體（Liver lysosomes）、腫瘤細胞（Tumor Cells）、純化的組織蛋白酶B（Cathepsin B）、組織蛋白酶M（Cathepsin M）、組織蛋白酶L（Cathepsin L）、葡萄糖醛酸酶（Glucuronidase）、谷胱甘肽（Glutathione，GSH）、天冬酰胺內肽酶（萊古酶，Legumain）等，應針對不同連接子類型選擇合適的體系。

IPHASE為助力客戶進行payload釋放試驗，研發并生產了人、猴、犬、大鼠、小鼠等多個種屬的酸化肝勻漿液、肝S9、溶酶體及組織蛋白酶B等產品，并進行了相應質控。以食蟹猴肝溶酶體為例，IPHASE使用終濃度1uM的組織蛋白酶B陽性藥物Z-RR-AMC進行代謝試驗，輔以IPHASE自研溶酶體代謝緩沖液（Catabolic buffer），在PH5.0的環境下使用LC-MS/MS儀器于37℃下分別采集0，30，60，90及120min下Z-RR-AMC的剩余量，其中肝溶酶體的蛋白濃度為0.5mg/ml，發現孵育30min后Z-RR-AMC藥物代謝量大于90%，說明IPHASE食蟹猴肝溶酶體中組織蛋白酶B具有高活性！同時，IPHASE也正在開發肝溶酶體及組織蛋白酶B對于陽性藥物德曲妥珠單抗（Enhertu，DS8201）的切割體系，以完善對產品的質控標準！

【ADC藥物的不可切割連接子】

繼了解了可切割連接子類型后，還有一種是不可切割連接子。不可切割連接子依賴于細胞質和溶酶體蛋白酶對ADC抗體成分的完-全降解，并最終釋放與降解抗體衍生的氨基酸殘基連接的有效載荷分子，包括硫醚和馬來酰亞氨基己酰基（MC）兩類，它們由穩定的鍵組成，防止蛋白水解裂解，并確保比其可裂解的對應物更大的穩定性。因此，不可切割連接子提高了血漿內的穩定性，且降低了脫靶毒性，但其也需要腫瘤細胞高表達抗原，且偶聯藥物要有強的內化能力。因此，對于不可切割連接子而言，使用酸化肝勻漿液、肝S9及溶酶體等產品便于較好地降解抗體部分并釋放payload。

下表為目前已公布的ADC藥物種類及其對應的連接子和小分子毒素類型。

四、ADC藥物的payload研究

繼了解ADC藥物連接子類型后，研究另一個ADC藥物的重要組成——有效載荷（payload）至關重要！有效載荷的活性和理化性質直接影響著ADC藥物的抗腫瘤療效。有效載荷的作用機制是決定ADC性能的一個重要因素。此外，ADC有效載荷的其他特性，如細胞毒性、免疫原性、制備和循環過程中的穩定性、水溶性和可修飾性也很重要。一般理想的有效載荷需具備以下幾點優勢：

目前，常用的細胞毒性藥物效應分子為微管抑制劑（如：auristatins、maytansinoids）、DNA損傷劑（如calicheamicin、duocarmycins、anthracyclines、pyrrolobenzodiazepine dimers）和DNA轉錄抑制劑（Amatoxin和Quinolinealkaloid (SN-38)）。

無論是哪種連接方式斷裂下的有效載荷，都需按照小分子藥物對其ADME及藥物相互作用進行深入分析，尤其是全新或帶有部分抗體片段或部分連接子的小分子，應按照新化合物對其進行研究分析，深入了解其吸收、分布、代謝和排泄的過程，以防未知的代謝對組織產生額外的毒性作用。因此，對有效載荷的研究常通過全血（Blood）、血漿（Plasma）、肝勻漿液(Liver Homogenate)、肝細胞（Hepatocytes）、肝S9（Liver S9 Fraction）、肝微粒體(Liver Microsomes)及CYP重組酶（CYP Recombinase）和UGT重組酶（UGT Recombinase）等產品研究其藥物本身及代謝產物的生成，同時也需要確定其與轉運體的關系。除此以外，作為全新的化合物，對其進行毒理學的研究也是非常必要的，即應對該化合物進行體外遺傳毒理試驗，包含但不限于細菌回復突變（Bacterial Reverse Mutation Test，即Ames Test）、使用小鼠淋巴瘤細胞（L5178Y）的TK基因突變（TK Gene Mutation Test）和HPRT（HGPRT）基因突變（HPPRT Gene Mutation Test）及使用中國倉鼠肺細胞（CHL）進行試驗的體外染色體畸變（In Vitro Chromosome Aberration Test，即CA Test）等，便于更加全面地了解該化合物的毒性影響！

鑒于此，IPHASE作為體外研究生物試劑引-領者，不擔擁有人、猴、犬、大鼠、小鼠等多種屬多類別的自研產品，且對每種產品質量進行嚴格把控，為客戶提供最佳的使用感。以血漿產品為例，IPHASE為更好地服務客戶，將血漿產品分為普通血漿、PPB專用血漿、血漿穩定性試驗專用血漿及PPB和穩定性均經驗證過的血漿，不同適用性產品使用不同小分子陽性藥物進行驗證。其中，PPB專用血漿使用終濃度為5uM的華法林，使用IPHASE自研平衡透析裝置或快速平衡透析裝置，驗證不同種屬下血漿的PPB結合率，將滿足要求的批次分別記錄，根據客戶需求進行售賣，減少了客戶的驗證時間和試驗誤差，大大縮減了客戶試驗周期。以下為IPHASE技術人員使用快速平衡透析裝置以SD大鼠血漿進行的PPB試驗，使用華法林為陽性藥物，在37℃、5% CO2培養箱中振蕩孵育6小時。其中，Rat-6h-PBS是陰性對照組，Rat-6h是試驗組，結果顯示其血漿蛋白結合率高于99%，滿足大鼠血漿蛋白結合率≥98%的要求。

綜上所述，作為具有精準靶向性、減少等正常細胞損害及可克服耐藥性的新型腫瘤治療藥物ADC，已逐步成為腫瘤治療領域的熱門方向之一。因此，完整的非臨床研究對其至關重要，以下為IPHASE/匯智和源可為廣大ADC藥研發客戶提供的完整體外非臨床研究“一站式"解決方案產品，以期同廣大客戶一起，更好的為新藥研發貢獻力量！

IPHASE/匯智和源憑借多年的研發經驗，推出了多領域、多種類的高-端科研試劑，為藥物早期研發提供篩選工具，為生命科學領域的探索提供新材料、新方法和新手段，為食品、藥品、化學品等的遺傳毒性研究提供便捷產品，望廣大科研工作者咨詢。

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