組織蛋白酶B：背后蘊藏的Linker“切割”力量

抗體偶聯藥物（Antibody-Drug Conjugate，ADC）是近年來腫瘤靶向治療領域發展最快的藥物類別之一。連接子(Linker)連接著細胞毒性藥物和抗體，是ADC藥物的關鍵部件之一。ADC中的連接子可分為可裂解和不可裂解兩種形式，目前的ADC研究主要集中在可裂解連接子上。而在可裂解連接子中，組織蛋白酶可裂解連接子是目前應用最-廣泛以及研究最深入的，其中組織蛋白酶B發揮著至關重要的“切割"作用。

ADC藥物簡介

抗體偶聯藥物（Antibody-Drug Conjugate，ADC）由靶向腫瘤特異性抗原或者靶向腫瘤相關抗原的單克隆抗體(Antibody)，與不同數目的小分子細胞毒素(Payload)通過連接子(Linker)偶聯而成（圖1），兼具傳統小分子藥物的殺傷效應和抗體藥物的靶向性，已成為腫瘤靶向治療的重要藥物之一。ADC藥物的核心作用機制是在胞內釋放出活性細胞毒素(Payload)，干擾關鍵細胞機制，從而殺死靶細胞。因此，Payload的釋放機制是ADC藥物研發的關鍵點。

圖1 ADC藥物的結構和功能示意圖（來源：Antibody drug conjugate: the“biological missile" for targeted cancer therapy）

Payload的釋放機制因連接子類型而異。ADC中的連接子可分為可裂解和不可裂解兩種形式。可裂解連接子主要為敏感性的化學鍵，可以根據體內環境的特異性化學物種（如谷胱甘肽、酸堿性等）或酶濃度不同，促進連接子與藥物裂解，主要通過腙鍵、二硫鍵、多肽的形式連接。不可裂解連接子沒有可觸發裂解的內置化學鍵，需要在癌細胞的溶酶體中將抗體通過蛋白質水解機制變成氨基酸，進而釋放帶有連接子和氨基酸片段的細胞毒性藥物，主要通過硫醚的形式連接。

【可裂解連接子】

腙鍵特點：對pH值敏感。在血液環境（pH 7.35-7.45）穩定，而在酸性細胞區室，例如溶酶體(pH 4.5-5.0)中會被水解釋放Payload; 腙鍵連接子在血液循環過程中并不穩定，易造成脫靶效應，目前其應用主要局限于血液瘤。

二硫鍵特點：可被谷胱甘肽(GSH)還原裂解。胞外體液環境中谷胱甘肽的濃度為2-20μmo/L，遠低于細胞質中谷胱甘肽的濃度(1-10 mmol/L)，而腫瘤細胞中GSH濃度會更高，從而還原切割二硫鍵，促進Payload的釋放。因此，二硫鍵連接子在循環系統中相對穩定，并具有一定腫瘤特異性。

糖苷鍵特點：可被β-葡萄糖醛酸酶和β-半乳糖苷酶切割。含有β-葡萄糖醛酸的連接子具有很高的親水性，可減少ADC的聚集，同時具有很好的穩定性。

肽鍵特點：可被組織蛋白酶B切割，這是一種溶酶體蛋白酶，在腫瘤細胞中過度表達，而在血液中存在蛋白酶抑制劑。因此，這種連接子在循環系統中高度穩定，而進入腫瘤細胞后會被溶酶體組織蛋白酶B切割，從而實現細胞毒性藥物在癌細胞中靶向釋放的功能。

【不可裂解連接子】

硫醚鍵特點：該類型連接子ADC的藥效發揮依賴于內吞機制，經腫瘤細胞內吞后進入溶酶體，ADC的抗體部分被降解，釋放出包含細胞毒素、linker和氨基酸殘基的復合物。這種連接子在血液環境中更加穩定，但帶電荷的氨基酸殘基會影響細胞毒素的細胞穿透膜能力，導致其不能發揮效“旁觀者效應"。

目前，組織蛋白酶B可裂解連接子是應用最-廣泛以及研究最深入的，同時也是目前唯-一有實際應用于上市ADC藥物的酶裂解型連接子。目前全球已上市的ADC藥物達15款，其中有8款是組織蛋白酶B可裂解的Linker（表1）。下面，讓我們一起來揭開具有強大“切割"力量的組織蛋白酶B的神秘面紗。

表1  全球已上市的ADC藥物一覽

組織蛋白酶B：背后蘊藏的“切割"力量

組織蛋白酶B（Cathepsin B）是一種半胱氨酸組織蛋白酶，屬于半胱氨酸蛋白酶家族，是一種胞內酶，主要分布于細胞溶酶體中。在病變情況下，也會分泌到細胞膜外周微環境或者胞外。組織蛋白酶B由一個重鏈和一個輕鏈組成的二聚體，具有羧基肽酶和內肽酶活性。羧基肽酶活性使得組織蛋白酶B可選擇性識別某些氨基酸序列以切割序列 C 端側的肽鍵接頭，例如纈氨酸-瓜氨酸（Val-Cit）、纈氨酸-丙氨酸（Val-Ala）和甘氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-甘氨酸（GGFG）等。這些Linker在已獲批的ADC中廣泛應用，具體裂解過程如圖2所示。內肽酶活性則使組織蛋白酶B參與細胞外基質的降解，從而涉及腫瘤的侵襲和轉移。

圖2 組織蛋白酶B催化肽鍵連接子的裂解過程示意圖（來源：抗體偶聯藥物連接技術的研究進展）

由于組織蛋白酶B在多種腫瘤細胞中過表達，如乳腺癌、肝癌、肺癌、黑色素瘤、胰腺癌、卵巢癌、前列腺癌、胃癌、結直腸癌、宮頸癌、甲狀腺癌等，并且是一種特異性的胞內酶，因此是現在ADC藥物研發主要考慮的Linker裂解酶，可以實現特異性和高效的胞內切割。另外，其他處于早期研究的Linker裂解酶還有組織蛋白酶M、組織蛋白酶L、β-葡萄糖苷酶、β-半乳糖苷酶、硫酸酯酶、磷酸酶和天冬酰胺內肽酶（萊古酶）等。

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IPHASE技術人員通過測定底物Z-RR-AMC的代謝減少速率來評估組織蛋白酶B的活性。孵育體系中組織蛋白酶B終濃度為2μg/ml，底物Z-RR-AMC終濃度為1μM，孵育時間為60min，最終測得組織蛋白酶B的活性為8000pmol/min/mg。

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參考資料：

[1] Zhiwen Fu, Shijun Li, Sifei Han, et al. Antibody drug conjugate: the“biological missile" for targeted cancer therapy. Signal Transduction and Targeted Therapy.2022,7(1):93

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