解決脂溶性維生素檢測干擾難題：專業去除脂溶性維生素血清、血漿方案

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體外診斷（In Vitro Diagnostics, IVD）是一種醫療檢測方法，廣泛應用于各種疾病的預防、診斷、療效觀察等方面，對于提高診斷的準確性、治療的有效性等情況，具有積極的意義。它通過分析人體的體液、細胞或組織樣本，為醫生提供了寶貴的診斷信息，進而輔助制定治療計劃。近年來，液相色譜-串聯質譜法（LC-MS/MS）在體外診斷領域的應用日益廣泛（如新生兒遺傳代謝病篩查、維生素檢測、腫瘤標志物檢測、治療藥物監測等）。LC-MS/MS法是基于被測生物標志物本身分子量、結構等化學性質的直接分析法，相較于其他檢測手段，展現出顯著的競爭力。IPHASE作為體外研究生物試劑引-領者，針對IVD維生素類產品開發的LC-MS/MS的檢測需求，現已生產出去除維生素A血清（Vitamin A-depleted Serum）、去除維生素A血漿（Vitamin A-depleted Plasma）、去除維生素D血清（Vitamin D-depleted Plasma）、去除維生素D血漿（Vitamin D-depleted Plasma）、去除維生素E血清（Vitamin E-depleted Serum）和去除維生素E血漿（Vitamin E-depleted Plasma）等空白生物基質，是體外診斷脂溶性類維生素客戶不-可或-缺的關鍵基質之一！

01    空白生物基質的重要性

在質譜法體外診斷分析中，空白生物基質特指不含目標分析物，但保留生物樣品本身的基質成分（如蛋白質及其代謝物、脂質、電解質、內源性小分子等）的空白生物樣品。

在質譜法檢測生物樣本內源性物質（如維生素、激素、代謝物等）和常見藥物時，空白生物基質的重要性貫穿于檢測的全流程，為分析方法的準確性、可靠性提供至關重要的保障?？瞻咨锘|讓校準曲線中的標準品與實際樣本處于完-全一致的基質環境中。此時，標準品的離子化行為（受基質效應影響的程度）與樣本中目標物完-全相同，確保目標物的信號強度與實際濃度成正比。這是定量準確性的根本前提。在方法驗證中，空白生物基質是加標回收實驗的基礎：通過向空白生物基質中加入已知濃度的標準品，制備質控樣品，計算回收率，才能對樣品前處理（如萃取、凈化）和檢測過程的可靠性進行驗證。

因此，合適的空白生物基質對于體外診斷試劑盒開發而言具有重要意義！血液類樣品是體外診斷最主要的樣本類型之一。然而，在臨床診斷中研究者發現在一些疾病診斷中，血清（Serum）或血漿（Plasma）中的脂溶性維生素（Fat Soluble Vitamins）的含量會干擾對其他指標的判斷。因此，為了準確測定其他物質的含量或指標的變化，需將血清或血漿中的脂溶性維生素去除。

脂溶性維生素(Fat Soluble Vitamins)是不溶于水而溶于脂肪及非極性有機溶劑(如苯、乙-醚及氯仿等)的一類維生素，包括維生素A、維生素D、維生素E。這類維生素一般只含有碳、氫、氧三種元素，在食物中多與脂質共存，其在機體內的吸收通常與腸道中的脂質密切相關，可隨脂質吸收進入人體并在體內儲存(主要在肝臟)，排泄率不高；攝入量過多易引起中毒現象，若攝入量過少則緩慢出現缺乏癥狀。另外，脂溶性維生素大多穩定性較強。下面為幾種脂溶性維生素主要作用。

 維生素A

（1）增強視網膜感光力參與視紫紅質的合成，缺乏時視紫紅質合成減少，對弱光敏感性降低，在弱光下視物模糊，稱為夜盲癥；

（2）維持上皮組織結構的完整性和功能參與糖蛋白合成，缺乏時可引起上皮干燥、增生及角化，如皮脂腺角化，出現丘疹；淚腺細胞角化，淚液分泌減少，眼部干燥，稱為眼干燥癥；

（3）促進機體正常生長發育促進骨細胞的分化，維持成骨細胞及破骨細胞之間的平衡；促進蛋白質、黏多糖及類固醇的合成，缺乏時組織生長發育不良；

（4）促進吞噬細胞和淋巴細胞的功能，促進細胞因子的釋放，增強機體免疫力；有效抑制氧自由基的活性，保護細胞免受傷害，具有一定的癌癥預防作用。

 維生素D

（1）促進鈣、磷在小腸和腎小管的吸收，維持正常穩定的血鈣和血磷濃度；

（2）在甲狀旁腺素和降鈣素的協同下，促進骨鈣入血，維持血鈣和血磷的平衡；

（3）促使鈣沉著于新骨形成部位，促進生長和骨骼鈣化，促進牙齒健。

 維生素E

（1）抗氧化作用能抑制不飽和脂肪酸的氧化，減少過氧化脂質的形成以及對機體生物膜的損害，有抗衰老、抗癌及防止動脈粥樣硬化作用；

（2）維持和促進生殖功能使促性腺激素分泌增加，促進精子生成和運動，增加卵泡生長和孕酮的分泌；

（3）參與多種酶活動增強微粒體中混合功能氧化酶的活性，抑制脫氧核糖核酸等分解酶系統，并對含巰基酶有保護作用；

（4）其他維持毛細血管的正常通透性，增加血流量，修復血管壁損傷后的瘢痕，抑制血小板聚集，防止血栓形成；維持骨骼肌、心肌和平滑肌的正常結構和功能。

由上可知，脂溶性維生素主要儲存于肝臟組織中，但在個體其余組織或體液中也均有存在，包括作為體外診斷主要樣本類型之一的血液樣本。血液樣本包含全血、血清和血漿三種類型，其中全血由血細胞和血漿組成，應用于臨床血液學檢查，如紅細胞計數、分類和形態學檢查等；血漿是血液加入抗凝劑后，經離心分離得到的液體，含有纖維蛋白原、白蛋白、球蛋白以及各種凝血因子，這些成分共同維持著血液的凝固功能；而血清則是血液在體外自然凝固或加促凝劑后分離出的淡黃色透明液體，它主要含有白蛋白、球蛋白及各種無機離子。

血清或血漿中的生理成分與機體組織間液比較接近，更能真實地反應機體的生理情況，反應其病理改變也更加靈敏。因此，在某些疾病診斷中，為避免脂溶性維生素對于特定疾病或研究的影響，合理的去除血清或血漿中的脂溶性維生素顯得尤為重要！

02    去除脂溶性維生素的方法

由上可知，在一些特殊情況下，需采用合理的方法將血清或血漿中的脂溶性維生素去除。目前市面上常見的維生素去除方法如下：

 有機溶劑提取法：取一定量的血漿或血清樣本，加入適量的乙酸乙酯或氯仿，震蕩，使有機溶劑與維生素D充分混合，離心即可得到不含維生素D的血漿或血清。

【優點】操作簡單：步驟較少，易于實施。成本低：所需試劑和設備較為常見。

【缺點】選擇性差：可能同時提取其他脂溶性物質。溶劑殘留：可能影響后續實驗。

 透析法：使用特定孔徑的透析膜，置于緩沖液中，維生素D可以通過微孔膜，遂去除。

【優點】溫和，不破壞樣品中的蛋白質和其他大分子；操作簡單，無需復雜設備。

【缺點】耗時長，通常需要數小時至數天；效率低：對小分子去除效果有限。

 固相萃取（SPF）法：使用C18或其它反相柱，先吸附基質中的脂溶性成分，而后用有機溶劑洗脫。

【優點】選擇型好，能有效分離脂溶性物質；樣品損失少：回收率較高。

【缺點】操作復雜，步驟較多，需優化條件；成本較高，固相萃取柱價格較貴。

 色譜法：使用高效液相色譜（HPLC）或氣相色譜（GC）分離并去除維生素D。

【優點】高分離度，能精確分離復雜樣品中的特定成分；靈敏度高，適合微量分析。

【缺點】設備昂貴，需用專業儀器；操作復雜，需專業人員操作。

 免疫吸附法：使用抗維生素D的抗體，通過免疫吸附去除基質中的維生素D。

【優點】特異性強，抗體能特異性結合維生素D；高效，去除效果顯-著。

【缺點】成本高，抗體價格昂貴；操作復雜，需優化實驗條件。

 物理吸附法：先用水解試劑使與蛋白質結合的維生素D分離，使其游離，再利用活性炭等物理方法進行吸附去除。

【優點】操作簡單，成本較低，無化學污染，廣譜吸附性，可調節性強。

【缺點】受環境影響較大，吸附選擇性差。

然而，不同的應用場景需要適配不同的去除方法。如以上的有機溶劑提取法、SPF法、色譜法及透析法，都不可能避免的會或多或少的改變血漿的性質。因此，常規獲取去除維生素血清/血漿，需采取更溫和的手段，即免疫吸附或物理吸附法。IPHASE作為體外研究生物試劑引-領者，以物理吸附為原理，成功去除了血漿/血清中的維生素。并以維生素D為例，進行了去除維生素D血清的LC-MS/MS分析。

03    IPHASE 去除維生素D血清的LC-MS/MS分析

維生素D水平異常往往涉及多系統功能（如視覺、骨骼、凝血、免疫），準確測定結果能為臨床決策提供直接依據（如補充劑量調整、疾病風險分層），尤其對特殊人群（早產兒、慢性病患者、長期服藥者）的健康管理具有不可替代的意義。利用液相色譜-串聯質譜法，檢測血清樣本中25-OH維生素D2和25-OH維生素D3，是目前體內維生素D檢測的主要手段。

《液相色譜-串聯質譜法檢測25-羥維生素D標準化專家共識》指出：質控樣本基質應盡量和患者樣本基質保持一致，以減小樣本處理和離子化中的基質效應。因此，去除25-羥維生素D的血清是該定量分析中不-可或-缺的關鍵材料，其核心意義在于通過消除基質干擾、模擬真實樣本環境，為準確、可靠的檢測結果提供保障，最終支撐臨床診斷、治療監測和健康評估。

然而，空白生物基質的缺失會直接打破“基質匹配"的平衡，對檢測的準確性、可靠性及應用價值造成多重沖擊，也是目前公-認的行業痛點：

（1）定量準確性顯著下降，結果嚴重偏差；

（2）基質效應無法控制，方法重現性差；

（3）方法驗證受阻，可信度無法確認；

（4）臨床決策風險劇增，結果失去參考價值；

（5）替代“人工模擬基質"和人工基質無法完-全復制生物基質中復雜的小分子網絡（如內源性代謝物、脂肪酸），無法消除基質效應，無法模擬分析目標物與血清中大分子可能的相互作用。

不同實驗室因使用的替代基質不同，可能導致檢測結果缺乏可比性，跨實驗室數據無法互認。

鑒于此，IPHASE通過優化物理吸附技術，實現了對血清中維生素D相關化合物的高效去除，得到去除維生素D空白血清，可應用于科研即時檢測、IVD試劑研發及部分基層臨床調控等方面。

為驗證IPHASE產品的合格性，IPHASE技術人員進一步利用LC-MS/MS評估了25-羥維生素D去除效果。圖1為去除VD空白基質（紅色）和該空白基質中添加1 ng/mL 25-羥基維生素D2（藍色）的檢測結果，保留時間為4.13 min；圖2為去除VD空白基質（紅色）和該空白基質中添加1 ng/mL 25-羥基維生素D3（藍色）檢測結果，保留時間為4.02 min。前處理方法為液液萃取。結果顯示：該產品對VD的去除效果良好，產品中25-羥維生素D的殘留大大低于1ng/mL。同時，去除后產品中蛋白濃度，鈉、鉀、鈣、氯等元素含量及脂質濃度，均與去除前相當（分別通過BCA法、ICP/MS法、元素分析儀法及脂質組學方法檢測）。

圖1 空白血漿去除25-羥基維生素D2及 1ng/mL添加結果圖

圖2 空白血漿去除25-羥基維生素D3及 1 ng/mL添加結果圖

利用去除VD血清產品，構建了校準品（8個濃度點，0.5ng/mL-160ng/mL）和質控品（25-羥維生素D2：5ng/mL、20ng/mL; 25-羥維生素D3：15ng/mL、70ng/mL），并進行了LC-MS/MS分析。表1為利用去除VD血清產品構建的25-羥基維生素D2和25-羥基維生素D3的校正-品和質控品，進行的LC-MSMS方法驗證結果，分析中采用了同位素內標。結果顯示，8個校正-品的校正曲線和2濃度質控品的精確度結果，均表現良好，且基質干凈，可在正常檢測水平基礎上延伸下限。校正曲線線性范圍為0.5~160 ng/mL，25-羥基維生素D2線性擬合R=0.9993，截距為0.0226，25-羥基維生素D3線性擬合R=0.9995，截距為0.0305。圖3和圖4分別為25-羥基維生素D2和25-羥基維生素D3校正曲線擬合結果。

表1 空白血漿制備25-羥基維生素D2和25-羥基維生素D3校正曲線和質控樣品結果

* 注：SD為Standard，QC為Quality Control

圖3 空白血漿25-羥基維生素D2校正曲線（0.5 ~160ng/mL）

圖4 空白血漿25-羥基維生素D3校正曲線（0.5 ~160ng/mL）

04    IPHASE產品

綜上，表明IPHASE去除維生素D血清效果優秀，滿足需求。IPHASE作為體外研究生物試劑引-領者，針對IVD維生素類產品開發的LC-MS/MS的檢測需求，也為滿足不同疾病研究或不同產品開發的需求，現已生產出去除維生素A血清（Vitamin A-depleted Serum）、去除維生素A血漿（Vitamin A-depleted Plasma）、去除維生素D血清（Vitamin D-depleted Plasma）、去除維生素D血漿（Vitamin D-depleted Plasma）、去除維生素E血清（Vitamin E-depleted Serum）和去除維生素E血漿（Vitamin E-depleted Plasma）等空白生物基，為不同研究需求的客戶提供最完整的產品鏈，節省時間且節約成本。

除去除脂溶性維生素的血清及血漿產品外，IPHASE常規多種屬、多規格的空白血清及血漿產品種類齊全，真正做到了為客戶提供“一站式"血液類樣本提供服務。同時，IPHASE也含有糞便、尿液、房水等多類型空白生物基質，以供不同需求的客戶選用。

IPHASE生產產品均具有以下優勢：

合規性 產品來源均由正規渠道獲得，來源清晰。

安全性 生產產品來源均經過病原檢測，保證產品質量安全。

高質量 生產產品均經過嚴格的內部質控，且同批次數量多，批次間差異性小。

可定制 可根據客戶特殊需求，提供特殊種屬、特殊產品的定制服務。