體外ADME研究——藥物Ⅱ相代謝穩(wěn)定性試驗

Keywords：Microsomes, Phase Ⅱ Metabolism; Hepatocytes; UDPGA; UGT; Drug Metabolism; Phase Ⅰ Metabolism

藥物代謝（Drug Metabolism）研究是創(chuàng)新藥物研發(fā)的重要內容，它不僅決定了創(chuàng)新藥物制劑研發(fā)的成敗，而且與創(chuàng)新藥物研發(fā)的速度和質量有密切關系。由于肝臟是藥物代謝的主要場所，體外代謝模型多以肝臟為基礎。目前，研究體外代謝方法主要有：肝微粒體（Liver Microsomes）體外溫孵法、重組P450酶（Recombinant P450 Enzyme）體外溫孵法、肝細胞（Hepatocytes）體外溫孵法、肝臟離體灌流法和肝切片法。其中，肝微粒體與肝細胞體外溫孵法較其它方法而言，制備簡單，代謝過程快，重現(xiàn)性好，易大量操作，可用于藥物代謝酶的抑制及體外清除等方面的研究，因而在實際工作中應用較為普遍。

一、藥物的Ⅱ相代謝反應

藥物代謝是指藥物在體內發(fā)生的化學變化，導致藥物結構發(fā)生改變，也被稱為藥物在體內的生物轉化。肝臟是藥物代謝的主要器官，藥物在肝內藥物代謝酶的作用下經過不同程度的結構變化，即I相代謝反應（Phase I Metabolism）和II相代謝反應（Phase II Metabolism）。其中，Ⅱ相代謝（Phase Ⅱ Metabolism），又稱結合反應，指Ⅰ相代謝產物或原型藥物在酶的影響下與內源性小分子（如葡萄糖醛酸、甘氨酸、硫酸等）結合或經甲基化、乙酰化排出體外。藥物的結合反應，常常使其轉化為無活性的代謝物，且極性增加，以便藥物排出體外。

在藥物的Ⅱ相代謝中，葡萄糖醛酸結合反應是體內生物轉化最重要、最-普遍的結合反應，而該類型的發(fā)生通常需UGT來介導。UGT家族是人體內僅次于CYP450家族的第2大藥物代謝酶。UGT催化的葡萄糖醛酸化代謝反應是以尿苷5’-二磷酸葡萄糖醛酸（UDPGA）為葡萄糖醛酸的供體將一分子的葡萄糖醛酸轉移到含有羥基、羧基、氨基、巰基以及酸性碳原子等基團的脂溶性小分子底物上。葡萄糖醛酸和小分子底物的結合使這些脂溶性小分子底物的水溶性得到改善，進而更容易被排出體外。

UGT介導的葡萄糖醛酸結合代謝不僅會顯著影響藥物的口服生物利用度和藥物的體內藥動學過程，同時還與一些臨床藥物-藥物相互作用、藥物-草藥相互作用、藥物-食物相互作用，以及高膽紅素血癥、癌癥、自身免疫性肝炎等多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關。因此，合理的體外代謝模型于研究藥物的二相代謝反應具有重要意義。目前，常使用的體外代謝模型有肝微粒體（Liver Microsomes）和肝細胞（Hepatocytes）兩種。

二、肝微粒體體外溫孵法

微粒體（Microsomes）是指在細胞勻漿和差速離心過程中獲得的由破碎的內質網(wǎng)自我融合形成的近似球形的膜囊泡狀結構，是異質性的集合體。它包含內質網(wǎng)膜和核糖體兩種基本成分，在體外實驗中具有蛋白質合成、蛋白質糖基化和脂類合成等內質網(wǎng)的基本功能，廣泛存在于肝臟等多個器官中，主要為I相細胞色素CYP450酶（Cytochrome P450）和II相酶系UGT等，囊括了多種類型藥物的不同代謝途徑。

2.1肝微粒體體外孵育體系的建立

Ⅱ相代謝穩(wěn)定性（Phase II Metabolic Stability）研究的肝微粒體體外孵育體系，是由肝微粒體輔以氧化還原型輔酶，由微粒體中的糖醛酸轉移酶催化尿苷二磷酸葡萄糖醛酸（UDPGA），在模擬生理溫度及生理環(huán)境的條件下進行生化反應的體系。

推薦的孵育體系為：每個孵育體系總體積為200 µL，體系包括0.1M PH 7.4 的磷酸緩沖液（0.1M PBS），NADPH再生系統(tǒng)（1.3mM NADP，3.3mM的6-磷酸葡萄糖，0.4U/mL 6-磷酸葡萄糖脫氫酶，3.3 mM的氯化鎂，0.05mM 檸檬酸鈉），UGT孵育系統(tǒng)（5mM UDPGA，5mM D-葡萄糖二酸-1.4-內酯，50μg/mg蛋白的丙甲菌素），0.1 mg/mL~1 mg/mL肝微粒體蛋白，合適濃度的待測物，于37°C水浴孵育。每個樣品平行3次，將待測物換為7-羥基香豆-素，作為陽性對照；陰性對照組分三組：a.只加UDPGA；b.不加UDPGA，用0.1M PBS緩沖液替代，理論上不代謝；c. 只包含受試物和0.1M PBS緩沖液。于預設的反應時間點，如0,2,5,10,15,30,60 min后加入等體積預冷的乙腈終止反應。

2.2 IPHASE肝微粒體II相代謝穩(wěn)定性研究

為驗證孵育體系的適用性，IPHASE以蛋白濃度為0.5mg/ml 的lot number 為23H018猴肝微粒體為體外孵育模型，驗證終濃度為100μM的陽性藥物7-羥基香豆-素在體外的穩(wěn)定性，并利用色譜峰面積作為計算數(shù)據(jù)。即通過時間點占初始點百分比的回歸曲線計算確定化合物體外的半衰期。將受試物的零時濃度作為100%，2,5,10和30min各時間點濃度與零時濃度相比得剩余百分數(shù)，各時間點的底物剩余百分數(shù)的自然對數(shù)與孵育時間經線性回歸，最終求得斜率k。最終再由計算公式可進一步得到半衰期和清除率結果。

整個孵育體系如下：

結果如下：

半衰期=5.49 min；清除率=1263 uL/mg/min

除微粒體外，亞細胞結構S9和胞質液也常用于藥物的代謝輪廓研究。前者包含了完整的I相和Ⅱ相代謝酶的活性其孵育體系類似于微粒體，但其CYP450酶和UGT酶的純度較微粒體而言略低，因此S9可用于非主要酶系代謝的體外研究模型之一；后者包含了可溶性的Ⅱ相代謝酶，如NAT、GST、ST、TPMT等，在很多化療藥物的激活與解毒過程中發(fā)揮重要作用，由于該體系中只有Ⅱ相代謝酶存在，且相對于肝S9來講酶活還很高，因此可通過加入不同的輔酶來單獨研究某個亞型酶的代謝。

三、肝細胞體外溫孵法

除了肝微粒體，原代肝細胞（Primary Hepatocytes）也是II相代謝穩(wěn)定性試驗研究的常用體外模型工具之一。相較于肝微粒體這類亞細胞結果，原代肝細胞（Primary Hepatocytes）具有完整的細胞特性和生理水平的酶和輔助因子，既包括膜結合酶【如細胞色素P450（Cytochrome P450）混合功能氧化酶，為滑面內質網(wǎng)中的還原酶】，也包括胞質酯酶，擁有肝臟中所有的代謝途徑。因此，原代肝細胞（Primary Hepatocytes）被廣泛認為是構建體外肝臟模型的金標準，在藥物相互作用、藥物代謝和藥物毒性研究中受到研究者的青睞。

鑒于此，IPHASE用Lot number為K0125A051的小鼠原代肝細胞進行體外肝細胞孵育體系的驗證。IPHASE技術人員將細胞密度為0.5 million cells/mL的肝細胞同終濃度為1uM的陽性藥物米達唑侖共同孵育，于37℃、5% CO?培養(yǎng)箱中分別培育0、5、30min下藥物的剩余量，由此得出藥物的半衰期及清除率，符合IPHASE長久以來積累的歷史數(shù)據(jù)范圍值。因此，IPHASE原代肝細胞具有活性高、批次間穩(wěn)定性差異小及純度高等優(yōu)勢！

結果為：半衰期=5.11 min；清除率=271 uL/mg/min

綜上所述，II相代謝穩(wěn)定性試驗研究在藥物研發(fā)中至關重要，可幫助評估代謝途徑、預測清除率、優(yōu)化藥物設計、評估相互作用、支持臨床試驗、確保安全性，并滿足法規(guī)要求，因此，選擇合適的產品及體外孵育系統(tǒng)對該試驗研究至關重要！

四、IPHASE產品

因此，IPHASE作為體外研究生物試劑引-領者，為滿足不同客戶的需求，深耕細作，研發(fā)生產出多種屬、多品系的肝微粒體和肝S9，并提供相應II相代謝穩(wěn)定性研究的配套試劑，并嚴格質控，致力于為客戶提供最-優(yōu)質的產品。

IPHASE生產產品均具有以下優(yōu)勢：

合規(guī)性 生產產品的組織均由正規(guī)渠道獲得，來源清晰。

安全性 生產組織均經過病原檢測，保證產品質量安全。

高質量 生產產品均經過嚴格的內部質控，且同批次數(shù)量多，批次間差異性小。

可定制 可根據(jù)客戶特殊需求，提供特殊種屬、特殊組織產品的定制服務。

高服務 高質量的售后服務，為試驗順利保駕護航。

IPHASE/匯智和源憑借多年的研發(fā)經驗，推出了多領域、多種類的高-端科研試劑，為藥物早期研發(fā)提供篩選工具，為生命科學領域的探索提供新材料、新方法和新手段，為食品、藥品、化學品等的遺傳毒性研究提供便捷產品，望廣大科研工作者咨詢。

發(fā)    文    章    得    獎    勵

凡使用本公司產品，在國內及國際刊物上發(fā)表論文（論文發(fā)表日起一年內），并注明產品屬于我司所有，即可申請獎勵。根據(jù)發(fā)表刊物影響因子不同，給予不同金額獎品：

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