彗星試驗需要注意的事項

　　其原理是器官或組織經處理（如輻射、重金屬等）后，細胞中的DNA發生單鏈或雙鏈斷裂，經細胞及其核膜裂解后，DNA解旋，在電場作用下，DNA 斷片遷移出細胞核，形成彗星狀的電泳圖譜。正常細胞的大分子DNA在電場作用下遷移距離較短，DNA仍保留在細胞核的范圍，形成圓形或輕微拖尾的圖譜。根據電泳緩沖液的pH值不同，可分為中性彗星實驗（pH=8.4）和堿性彗星實驗（pH＞13）。中性彗星實驗主要用于檢測DNA雙鏈的斷裂損傷，堿性彗星實驗具有更高的靈敏性，可用于檢測更少量的單鏈和雙鏈斷裂損傷。

　　需要注意的是：

　　1、細胞一定要消化成單個的，如果待測的細胞是懸浮生長的，或者形狀是圓形的，可以直接用細胞刮收細胞做，如果細胞是非圓形的，例如成纖維細胞等，一定要用胰酶消化，使之成圓形，然后才可做實驗。很多做彗星實驗總是出不來結果的，可以考慮下是否是這方面的原因。

　　2、細胞裂解：裂解條件也是一個關鍵變量，可能會干擾特定類型的DNA修飾(某些DNA烷基化和堿基內收)導致的鏈斷裂。因此建議在實驗中對所有玻片的裂解條件盡可能保持恒定。準備好后，應在約2-8攝氏度的弱光條件下(如黃光(或防光)，將載玻片浸入冷凍溶解液中至少1小時(或過夜)，以避免暴露在可能含有紫外線成分的白光下。在此潛伏期之后，在堿液展開步驟之前，應沖洗載玻片以除去殘留的洗滌劑和鹽。這可以用純凈水、中和緩沖液或磷酸鹽緩沖液來完成。

　　3、電泳時，電流與電壓強度在每次實驗時要恒定，這樣出來的慧尾才有分析價值，將載玻片隨機放置在含有足夠電泳溶液的潛電泳裝置的平臺上，使載玻片表面全部覆蓋(每次覆蓋的深度也應一致)。

　　4、玻片準備：單細胞懸液制備后，應盡快(最好在1小時內)制備載玻片，但動物死亡與載玻片制備之間的溫度和時間應嚴格控制，并在實驗室條件下進行驗證。

　　5、掉膠的問題：蓋玻片最好兩面都涂上剝離硅烷(挺便宜的一大瓶，但是有毒)，這樣會好很多

　　6、電泳膠使用時需提前水浴融化，禁用微波，清洗玻片時注意不要直接將液體傾倒至膠面，防止脫膠。

　　7、使用組織進行彗星試驗時，需注意細胞制備需全程在冰上進行，且保證在1小時內完成鋪片。

　　8、測量方法：彗星應該使用自動化或半自動化的圖像分析系統進行定量評分。用合適的熒光染色劑對載玻片進行染色，并在配備有超熒光和適當檢測器的顯微鏡或數碼相機上進行適當放大(如200x)的測量。