Ficoll密度梯度離心法提取PBMC原理及注意事項

外周血單個核細胞（Peripheral Blood Mononuclear Cell，PBMC），是指外周血中具有單個核的細胞，包括淋巴細胞（Lymphocyte）、單核細胞（Monocyte）、樹突狀細胞（DC）和其他少量細胞。PBMC可通過健康人或動物供體的外周血，通過Ficoll密度梯度離心法（IPHASE/匯智和源），磁珠分選等步驟獲得。

　　Ficoll是蔗糖的多聚體，中性，平均分子量400,000，當密度為1.2g/mL，未超出正常生理性滲透壓，也不穿過生物膜。紅細胞、粒細胞比重大，離心后沉于管底；淋巴細胞和單核細胞的比重小于或等于分層液比重，離心后漂浮于分層液的液面上，也可有少部分細胞懸浮在分層液中。吸取分層液液面的細胞，就可從外周血中分離到單個核細胞。

人PBMC中不同細胞類型的比例

PBMC中大部分都是淋巴細胞，包括B細胞和T細胞，其中CD3 T細胞又占了淋巴細胞中絕大部分(45-70%)。這些T細胞都處于初始（naive）狀態，即已經成熟了但沒有受到抗原刺激。 在正常人中，只有非常小的一部分初始T細胞會因抗原識別而被激活。同樣的B細胞也都處于初始狀態。相對于淋巴細胞，單核細胞的比例在10-30%，收到刺激之后會發育成樹突狀細胞(DC)或巨噬細胞。干細胞的比例非常低，只有0.1-0.2%，因此很難從全血樣本中分離到。

一、外周血單個核細胞（PBMC）制備方法

1.設備與試劑

全血 （以10ml為例）

無菌PBS溶液(pH7.4) 或者生理鹽水

蔗糖溶液（Ficoll Pague PLUS) 

RPMI 1640培養基 

胎牛血清（FBS）

雙抗P/S （Penicillin/ Streptomycin) 

二甲亞砜（DMSO）

預先裝好異丙醇的凍存盒

2.方法/步驟

配制所需的溶液：

a. 細胞培養基：RPMI 1640+10% FBS+1% P/S；

b. 細胞凍存液：FBS中加入10%DMSO；

（1）將10ml全血轉入50ml離心管中，加入10ml PBS溶液稀釋，輕輕混勻；

（2）取兩支15ml離心管，先加入5ml Ficoll溶液。然后將稀釋的血液輕輕加到兩支離心管的ficoll上層，一定要輕柔，避免兩種溶液混合在一起，每只離心管各10ml稀釋血液；

（3）2,000rpm，20min，注意，降速設置中一定要設置成no break，或者只有1-2成的制動。離心完畢將得到如圖所示分層；

（4）PBMC所在細胞層為白色。此時可以用吸管將該層細胞吸取在另一干凈的15ml離心管中。

（5）加入PBS至10-15ml，1,500rpm，10min離心后去掉上清，再加入培養基進行相同操作的清洗；

（6）加入5-10ml培養基重懸細胞，進行后續計數培養或者鋪板；

（7）細胞凍存：將細胞離心收集之后，用細胞凍存液重懸。取1-1.5ml細胞至凍存管中，放入凍存盒（凍存盒可事先在4℃冰箱預冷）。再將凍存盒放置于-80℃冰箱過夜。第二天將細胞轉入液氮中長期保存。

IPHASE/匯智和源建議操作注意事項

（1）全血溶液可以加在Ficoll上層或者下層，但是最終都必須保證兩種溶液分層清晰。

（2）分離PBMC第一步離心的時候，一定不能設置或設置低水平的制動。否則將分層混亂。

（3）人PBMC和動物PBMC分離方法稍有不同，動物PBMC需求可聯系IPHASE/匯智和源。

細胞運輸與保存

（1）干冰運輸，收到細胞后立即轉入液氮凍存或直接復蘇；

（2）T25瓶運輸的新鮮細胞，收到后應繼續生長，傳代達到細胞生長狀態良好時，再進行凍存，具體操作步驟見細胞培養步驟。

PBMC收到后注意事項

（1）收到PBMC細胞后首先觀察細胞瓶是否完好，培養液是否有漏液、渾濁等現象，若有上述現象發生請及時反饋。

（2）先不打開瓶蓋，瓶身擦拭酒精后放培養箱靜置四小時，穩定細胞狀態，切忌在溫箱內靜置過夜。

（3）靜置后鏡檢，拍照，記錄細胞狀態。建議傳代后也拍照記錄細胞生長情況。

（4）貼壁細胞：若細胞密度超過80%，可正常傳代；若未超過80%，收集細胞瓶內的培養基，留8ml繼續培養至80%左右再傳代，瓶蓋可稍微擰松。

（5）細胞瓶內的培養基含血清和雙抗，可收集后4℃保存備用，可補加2%血清。剛開始傳代時建議一半用細胞瓶內的培養基，一半用自備的培養基，使細胞逐漸適應培養條件，以免因不適應而造成生長狀態不佳。

（6）細胞消化液建議使用PBS配制。

IPHASE/匯智和源其他外周血單個核細胞：

人外周血單個核細胞 Human PBMC

猴外周血單個核細胞 Monkey PBMC

比格犬外周血單個核細胞 Dog PBMC

大鼠外周血單個核細胞 Rat PBMC

小鼠外周血單個核細胞 Mouse PBMC

兔外周血單個核細胞 Rabbit PBMC

豬外周血單個核細胞 Pig PBMC

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